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Science综述:CRISPR技术革命

 

 

 

 

DNA编辑技术CRISPR近年来风生水起,已经开始取代了其它基因组编辑工具,如锌指核酸酶和 TALENs等。不过目前科学家们对于这一技术中的RNA引导核酸内切酶:Cas9了解的还不够多,如果能更精确的掌握这种酶在CRISPR系统中如何发挥作用的,将能提高这一技术的使用效率和特异性。
5月16日Science杂志发表了题为“Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution”的综述性文章,指出近期的一些生化试验和结构研究有助于解析Cas9这种关键酶,这些研究成果为未来合成生物学,转化医学研究,以及新一代基因组工程中的新应用奠定了基础。
CRISPR本身是一种防御系统,用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA 。当微生物感染了这些病毒中的一种,CRISPR RNA就能通过互补序列结合病毒基因组,并表达CRISPR相关酶,也就是Cas,这些酶都是核酸酶,能切割病毒DNA ,阻止病毒完成其功能。
将CRISPR/ Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件:一个Cas酶,用于切断靶标DNA,比如目的基因中的DNA片段,另外一个就是称为导向RNA(gRNA)的RNA分子,这种分子能通过互补结合靶标。
其中Cas酶至关重要,为了能更好的利用这一技术工具,不少实验室解析了这种酶的精确分子机制,探索其如何靶向和作用于DNA的。近期Sternberg等人就确定了Cas9在病毒感染过程中是如何在RNA序列的引导下识别和降解外源DNA,以及在动物和植物细胞中诱导位点特异性遗传改变的。
研究人员通过结合单分子成像和大量的生化试验,证实Cas9的基因组编辑能力是通过称作为“PAM”( protospacer adjacent motif)的短DNA序列来实现的。这一研究揭示了PAM的两个主要功能,解释了它对于Cas9能够靶向和切割与导向RNA相匹配的DNA序列如此至关重要的原因。在外源DNA的靶向位点附近存在PAM,而宿主基因组的这些靶向位点则缺乏PAM,使得Cas9能够精确区分必须降解的非自身DNA和几乎完全相同的自身DNA。此外,存在PAM也是激活Cas9酶的必要条件。
研究人员指出,Cas9只在识别PAM后才利用RNA–DNA碱基配对来解读DNA寻找匹配的序列,这样避免了意外地靶向细菌自身基因组中的匹配位点。然而,即使Cas9以某种方式与自身基因组中的一段匹配序列错误地结合,没有PAM也无法触发催化核酸酶的活性。利用这种DNA解读机制,PAM提供了两个冗余的检查点,确保Cas9不会错误地破坏它自身的基因组DNA。
此外,在结构研究方面,瑞士苏黎世大学、美国加州大学伯克利分校等处的研究人员今年2月首次解析出酶Cas9的详细三维结构图:研究人员利用X射线晶体分析法获得两种主要类型的Cas9酶的2.6埃和2.2埃分辨率的晶体结构图。然后利用单颗粒电子显微术(single-particle electron microscopy)揭示出Cas9与它的导向RNA(guide RNA, gRNA)如何合作从而与靶DNA序列相互作用。 
结构分析显示Cas9具有相同的结构核心,这个结构核心的特征为一种具有两个主叶(major lobe)——一个核酸酶结构域叶和一个α-螺旋叶---的蛤蜊形状(clam-shaped)的结构。这两个主叶含有保守性的裂缝,而这些裂缝在核酸结合中发挥功能。
还有来自麻省理工等处的研究人员首次报道的Cas9复合体的高分辨率图片,从中揭示出这种Cas9复合体的劳动分工。
研究人员发现Cas9由两个裂片(lobe)组成:一个裂片参与识别向导RNA和靶DNA组分,另一个裂片负责切割靶DNA,导致双链DNA断裂从而让靶基因失去功能。而且他们也发现Cas9与导向RNA之间的界面上的关键性结构,当Cas9准备切割靶DNA链时,这些结构允许Cas9在导向RNA和靶DNA周围自我组装。
这些生化机理和结构上的重要成果将有助于解决CRISPR系统应用中的一些问题,从而更好的改进CRISPR技术,满足科学家们的要求。